血液凍干機(jī)：血小板凍干再水化的條件及其凝血功能變化

　　血小板(plaet)是由骨髓巨核細(xì)胞產(chǎn)生并釋放于血液循環(huán)中的zui小細(xì)胞,在止血和凝血過程中發(fā)揮著重要的作用。 由于血小板保質(zhì)期較短，臨床輸注需求量大， 加之臨床輸注需求時間的不確定性， 造成了血小板過期浪費(fèi)和臨床供不應(yīng)求的兩難尷尬局面。

目前國內(nèi)血小板主要保存方式是22℃振蕩保存，有效期為 5d。 此外血小板還可深低溫冰凍保存， 但這種方法的保存效果和臨床療效不確切。 冷凍干燥技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種生物材料的保存， 凍干制品具有常溫下保存、 性能穩(wěn)定、便于運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)。 本研究以過期血小板為原料，探索血小板凍干再水化的條件，檢測其凍干再水化后凝血功能的變化， 為過期血小板再利用及新鮮血小板冰凍或低溫保存研究提供了依據(jù)。

　　1、 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗材料

　　1.1.1 血小板來源 實(shí)驗組選擇體檢合格， 一周內(nèi)未服用阿司匹林等抗血小板藥物的自愿獻(xiàn)血者，用血細(xì)胞分離機(jī)單采富含血小板血漿，22℃振蕩保存 5d 過期；對照組選擇新鮮機(jī)采血小板。

　　1.1.2 主要試劑和溶液 海藻糖 (CH22O11·2H2O，北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司)； 牛血清白蛋白(BSA，上海生工生物工程有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)； 血小板聚集誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(ADP，Sigma公司)；凝血酶(Sigma 公司)；膠原(Sigma 公司)；瑞斯托霉素(Sigma 公司)；CD62P-PE(Bioscience 公司)；PAC-1-FITC(BDIS 公司 )； 海藻糖加載緩沖液 ( 含50mmol/L 海藻糖，100mmol/L NaCl，10mmol/L KCl，10mmol/L EGTA，pH 為 6.8)；凍干保護(hù)劑(含 20%海藻糖 ，1% 牛血清白蛋白 ，9.5mmol/L HEPES，142.5mmol/L NaCl，4.8mmol/L KCl，1mmol/L Mg-Cl2)；復(fù)水溶液為 PBS 緩沖液和蒸餾水以 3:1 比例混合制成。 以上試劑和溶液均在有效期內(nèi)。

　　1.2 主要儀器

凍干機(jī)

、恒溫振蕩水浴、流式細(xì)胞儀、血球計數(shù)儀、血小板聚集儀

　　1.3 實(shí)驗方法

　　1.3.1 血小板的凍干保存 血小板濃縮液離心洗滌后重懸于海藻糖加載緩沖液中， 將上述懸浮液轉(zhuǎn)移進(jìn)入離心管中，并用聚四氟乙稀生料帶密封，于37℃水浴中振蕩孵化 4h。 將孵化后的血小板懸浮液 800g 離心 3min。 去除上層孵化液，得到沉淀的血小板塊，加入凍干保護(hù)液打散重懸，使用血球計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)， 調(diào)節(jié)血小板在凍干保護(hù)液中的濃度為 1×109個/ml。 將制備好的血小板凍干懸浮液裝入特制凍干血盒中，密封充注口。 將血小板凍干懸液先以 20℃/min 的速率凍結(jié)至-40℃， 預(yù)凍 2h后，再以 1.5℃/min 對擱板升溫至-30℃，退火 0.5h，然后進(jìn)入一次干燥，-38℃維持一次干燥條件 20h，zui后以 0.2℃/min 的加熱速率使隔板溫度升高至20℃，維持二次干燥條件 10h 直至凍干結(jié)束。 凍干的血小板密封保存在室溫。

　　1.3.2 凍干血小板的水化 將 PBS 緩沖液和蒸餾水以 3:1 的比例混合制成血小板凍干復(fù)水液，將1ml 復(fù)水液在室溫下直接加入凍干樣品瓶中，輕輕震蕩直到樣品*溶解于復(fù)水溶液中。

　　1.3.3 檢測血小板回收率 用血球計數(shù)儀分別對凍干前和凍干再水化后的血小板計數(shù)， 計算凍干再水化血小板回收率。凍干再水化血小板回收率(%)=凍干再水化后血小板計數(shù)/凍干前血小板計數(shù)×100%。

　　1.3.4 檢測血小板穩(wěn)定性 凍干再水化血小板分別在室溫放置 0h、2h、4h、6h、8h 后，用血球計數(shù)儀測定血小板回收率。

　　1.3.5 血小板形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察 用掃描電鏡觀察血小板的形態(tài)；分別以戊二醛固定、脫水、環(huán)氧樹脂包埋后制作超薄切片， 用透射電鏡觀察血小板超微結(jié)構(gòu)變化。

　　1.3.6 血小板聚集反應(yīng)檢測 將凍干血小板復(fù)水后轉(zhuǎn)入離心管中進(jìn)行洗滌以去除細(xì)胞外保護(hù)劑，再用新鮮冰凍血漿重懸血小板， 調(diào)整血小板濃度為(0.2~0.3)×1012/L。 用 APACT-2 型血小板聚集儀檢測凍干再水化后血小板對四種同濃度誘導(dǎo)劑—凝血酶、膠原、ADP 和瑞斯托霉素的聚集反應(yīng)。

　　1.3.7 血小板表面糖蛋白檢測 用三色流式細(xì)胞儀分別檢測凍干再水化血小板表面激活指標(biāo) CD62p和 PAC-1 的表達(dá)，經(jīng)凝血酶激活后測定 CD62p 和PAC-1 的再表達(dá)。 再表達(dá)率=凝血酶處理后表達(dá)率-血小板表達(dá)率1.3.8 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用 SPSS16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理， 組間差異比較用 t 檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2、 結(jié)果

　　2.1 血小板回收率及穩(wěn)定性 實(shí)驗組和對照組間血小板計數(shù)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，凍干再水化血小板回收率為 49.36%，見表 1；凍干再水化血小板穩(wěn)定性隨血小板放置時間的延長， 血小板回收率逐漸下降，見圖 1。

　　2.2 血小板形態(tài)及超微結(jié)構(gòu) 掃描電鏡顯示新鮮血小板透光性較強(qiáng)，形態(tài)呈圓形或橢圓形，邊緣光滑， 而凍干再水化血小板透光性較弱， 血小板變形，見圖 2A 和 B。 透射電鏡顯示新鮮血小板著色較深，α 顆粒、致密顆粒、過氧化酶顆粒等分散、清晰，而凍干再水化血小板著色較淺，致密顆粒及 α顆粒不夠清晰，且數(shù)目少于對照組，見圖 2C 和 D。

　　2.3 聚集反應(yīng) 實(shí)驗組和對照組間血小板同濃度誘導(dǎo)劑下的zui大聚集率均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)，實(shí)驗組血小板對凝血酶、膠原、ADP 和瑞斯托霉素的聚集功能較對照組均出現(xiàn)下降，見表 2。

　　2.4 血小板表面糖蛋白 實(shí)驗組 CD62p 表達(dá)率和再表達(dá)率分別為 50.25%、94.27%，均顯著高于對照組的 8.12%、78.43%(P<0.05)；凝血酶作用后 CD62p再表達(dá)率為 44.02%，顯著低于對照組 70.31% (P<0.05)。 pac-1="" p="">0.05)，PAC-1 再表達(dá)率為42.75%，顯著低于對照組 67.29%(P<0.05)，凝血酶作用后 PAC-1 再表達(dá)率為 38.90%，顯著低于對照組 65.28%(P<0.05)，見表 3。

　　3、討論

　　血小板數(shù)目減少或功能不全所致出血性疾患的預(yù)防和治療，臨床多采用輸注血小板制劑。 血小板保存技術(shù)的缺陷是血小板過期浪費(fèi)和臨床供不應(yīng)求的兩難處境的主要原因，因此，研究出一種能長期、、安全和方便的血小板保存方法一直是國內(nèi)外輸血工作者關(guān)注的熱點(diǎn)和難題。

　　將過期的血小板再利用及血小板的凍干保存有著廣闊的應(yīng)用前景。 本研究顯示凍干再水化的過期血小板回收率及穩(wěn)定性較差， 說明凍干和再水化過程對血小板功能造成一定影響， 應(yīng)進(jìn)一步改進(jìn)凍干保存時擱板溫度，復(fù)水液組分和比例，以及增加預(yù)復(fù)水步驟。 透射電鏡下新鮮血小板著色相對較深， 可能為新鮮血小板生物活性較高或膜通透性相對較高，因而有較強(qiáng)吸附染料的能力。

　　CD62p 和 PAC-1 分別為血小板表面活化晚期標(biāo)志物和活化早期的標(biāo)志物， 結(jié)果顯示過期血小板對凝血酶、ADP、 膠原及瑞斯托霉素的zui大聚集率明顯小于新鮮血小板，凝血酶作用后 CD62p 和 PAC-1 的再表達(dá)率低于新鮮血小板，說明過期以及凍干和再水化過程對血小板凝血功能有影響， 但凍干再水化的過期血小板仍具有一定的存活能力和功能活性， 因此選擇血小板進(jìn)行冷凍干燥保存是血小板長期保存切實(shí)可行的方法， 為新鮮血小板冷凍干燥保存提供理論依據(jù)。 但對該方法保存血小板的回收率、 穩(wěn)定性以及凝血功能等還需做進(jìn)一步研究與改進(jìn)，以達(dá)到臨床應(yīng)用的要求。

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